大佬出新番了！RichardJude Samulski在Molecular Therapy上刚发表了一篇关于AAV载体的review，AAV Vectors The Rubik’s Cube of Human Gene Therapy。题目就很有意思，魔方本身有多个平面，每个平面上又有不同的颜色，各种角块、棱块的位置让魔方有海量的花色组合。AAV也是这样，不同的血清型，不同的衣壳改造方式，不同的表达框，也为科研人员带来了无尽的选择，两者之间是很有趣的类比。所以小编赶紧带大家来刷一刷这篇文章，看看AAV的哪些方面在文章里有被大佬点名~。

一．AAV的衣壳

1. 天然血清型

首先Richard带大家回顾了一下关于AAV血清型的基本知识。虽然我们常说目前已发现的AAV血清型有13种，但实际上这只是数百种血清型或不同的AAV变体中研究最多的一些亚类。根据共同的血清学和功能属性，其中一些AAV血清型又会被分为A-F支系。在常见的AAV载体中，AAV4和AAV5这两个血清型在衣壳蛋白序列上与其他血清型有较大的差异。尤其是AAV5，它与AAV2和AAV8仅有58%的壳同源率，与AAV10仅有57%的同源率。而相比之下，其他常见的AAV之间同源率往往超过80%。

• 衣壳序列中的可变区对应于VP结构中不同的构象环，这些构象环会与细胞表面的糖类或者受体结合，从而影响病毒的组织倾向性、转导效率和抗原性以及血清型之间免疫原性的交叉反应。许多AAV与细胞的的最初结合是通过与初级受体，包括糖类和蛋白多糖，如硫酸肝素、末端半乳糖（Gal）和sialic acid（SA）结合而开始的。AAV可根据其糖受体的使用情况分为三类。AAV2、AAV3、AAV6和AAV13使用HSPG；AAV1、AAV4、AAV5和AAV6用SA；AAV9用Gal15。AAV7、AAV8、AAVrh10、AAV11和AAV12的主要糖受体目前尚不清楚。但这种对糖类受体使用类别的分组是一种人为的简化，实际病毒与细胞的糖类识别情况要更为复杂（比如说从人类样本中分离出的70%以上的AAV2在585和588位缺少精氨酸残基，不能与HSPG结合，因此一定有其他的糖类可以与这类的AAV2相结合）。

• 在这种初始结合之后，AAV衣壳会与二级膜蛋白受体相互作用，从而促进内化。目前已有一系列二级受体的报道。例如AAV2会使用FGFR121、 CD9、αVβ5和α5β1整合素；AAV2与AAV3会使用c-MET； AAV5会使用的血小板衍生生长因子受体；AAV6会使用表皮生长因子受体；AAV2、AAV3、AAV8和AAV9会使用LamR等等。

• 150kDa的糖蛋白AAVR，也是许多 AAV进入细胞的的关键。目前对其的功能推测有很多种，例如帮助AAV被细胞吸收到内体中；在早期内体系统中，促进AAV被贩运到高尔基体中；在高尔基体中，促进AAV从高尔基体逃逸到细胞质中。但也有数据表明，似乎AAVR不参与细胞附着，而是仅仅促进了AAV的入核过程。

总之，特定糖类和蛋白质受体的组合是决定AAV血清型组织倾向性的主要因素。

2. 突变影响翻译后修饰

科研人员发现，在293细胞中生产得到的AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh10，有52种翻译后修饰，其中包括糖基化（36%）、磷酸化（21%）泛素化（17%）、SUMO化（13%）和乙酰化（11%）等等。这种翻译后修饰是异质性的，并且在sf9中生产出的AAV又与在293中生产的AAV不同。被作者点名的有：

• AAV1： N端乙酰化；K61、K459和K528甲基化；S149和S153磷酸化。丝氨酸和赖氨酸突变的AAV1载体（K137R、S663A和S669A）在体外和体内的转导都有增加。

• AAV2：AAV2的CAP有8段序列，是O型或N型糖基化的潜在位点。AAV2 衣壳在N253、N518、S537和N551处有糖基化，并且破坏N253的N-糖基化位点（突变体N253Q）严重影响了AAV2的包装效率，可能是去糖基化影响了载体的组装和稳定性。AAV2衣壳在酪氨酸残基处可以被EGFR-PTK磷酸化，磷酸化位点又会被泛素连接酶（phosphodegrons）识别为降解信号，从而导致其随后的泛素化以及降解进而影响细胞内转运和入核。因此，对衣壳表面暴露的酪氨酸残基进行点突变，是可以提高转导效率的，例如Y444F和Y730F以及Y444F+Y500F+Y730F等等。这些酪氨酸残基在大多数AAV血清型中都是高度保守的。

• AAV5：有几个PTM，包括N292的糖基化，K122、K451、K639的泛素化和N308、T 376。在AAV5中突变掉丝氨酸（S268A、S652A和S658A）和苏氨酸（T107A）磷酸化位点，可提高载体在体外和体内的表达效率。

此外，随着时间的推进，AAV载体活性的损失与脱酰胺现象是有一定相关性的，并且这种脱酰胺现象不是血清型特异性的，它在AAV1、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV7、AAV9和AAVrh32中都有发生。

3. 嵌合型衣壳

AAV衣壳改造的一个常见的理性设计方法是通过将一个血清型的功能区块嫁接到另一个血清型上，以此来构建嵌合体衣壳。这些功能区块通常是能够决定衣壳组织特异性的细胞受体结合区域。有时，仅一个氨基酸的替换就足以表现出一个明显不同的表型。但在大多数情况下，科研人员还是将多个残基或整个区域从一个血清型嫁接到另一个血清型，以达到所需的目标。其中被作者点名的有：

• AAV1-E531K和AAV8-E533K：使其具有肝素结合能力，转导效率提高。进行玻璃体内递送可以使其在眼内玻璃体和视网膜之间的内限膜处聚集。

• AAV2i8：一个AAV2/AAV8 的嵌合体，可以以高效率选择性地转导心脏和骨骼肌组织，穿越血管，降低肝脏趋向性，并明显改变其抗原谱。

• AAV2.5：4个突变Q263A, N705A, V708A, T716N,（AAV2编号）和一个插入T265（AAV1编号）,保留了AAV1的肌肉转导能力和AAV2与受体结合的能力，同时减少了对两个亲本血清型的交叉免疫反应。

• AV2G9：将AAV9的半乳糖结合脚印嫁接到AAV2中，使新衣壳可以同时利用Gal和硫酸肝素受体进行感染。AAV2G9在大脑中显示出强大的针对神经元转导的能力，并减少了对胶质细胞的感染。

4. 已知多肽、蛋白的插入

AAV衣壳改造一个常见的方法，是在特定的VP区域插入一段多肽或蛋白来创造嵌合型的AAV衣壳，这种插入的主要目的是通过插入的序列来改变自然AAV血清型的倾向性。因此，也有两个问题决定了最后的效果：插入什么和插入哪里？在本节被作者点名的有：

• AAV2：常见的插入点在584或588的位置。在AAV2外壳的587或588位插入肌肉靶向肽MTP插入后，两种病毒对分化的肌细胞的感染性不变或有所增强，并且对非肌肉细胞系和未分化的肌细胞的感染性都减弱了。在对AAV2衣壳的全面分析中，有研究在59个不同的位置构建了93个突变体，包括肽的插入和丙氨酸扫描。也有研究在VP1（残基34）或VP2（残基138）的N端区域插入serpin受体配体，从而改变了AAV2在体外的倾向性。也有研究在VP2的N端插入了不同类型的蛋白质。例如，插入了抗Her2/neu的DARPin，以便精确靶向肿瘤组织并传递自杀基因。也有研究将AAV2 GH2/GH3环的7个氨基酸（AAV2 VP1中的残基453- 459），用三种不同的纳米抗体取代，每个纳米抗体有110-130个氨基酸，从而使新衣壳分别对CD38、ARTC2.2和P2X7具有特异性。

• AAV9：eAAV9将胰岛素模拟肽（S519）插入AAV9的外壳，使其对表达 IR的细胞系、分化的原代人类肌肉细胞的转导效率明显提高，与AAV9相比，eAAV9在体内转导小鼠肌肉的效率是前者的18倍。

5. 衣壳的DNA shuffling

AAV衣壳改造另一个常见的方法，是将来自不同血清型的衣壳进行DNA shuffling，通过体外的基因随机同源重组来创造新的衣壳。这样会构建一个大型的衣壳嵌合文库，并通过经典的定向进化方法，去筛选出有特定表型的衣壳。在本节被作者点名的有：

AAV-DJ：该衣壳是将八个不同的野生型病毒进行DNA shuffling，然后在原代或转化的人类肝细胞上进行筛选后得到的。AAV-DJ载体在体外比八个标准AAV血清型（AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 8,和9）的感染力更强。AAV-DJ载体已被证明是针对视网膜疾病的基因治疗研究的有用工具，它能够通过玻璃体内注射将基因转移到光感受器层，并能有效地将基因转移到视网膜的各种类型的细胞中。

Chimeric-1829：该衣壳是将AAV1- 9 进行DNA shuffling后筛选得到的。正如其名称所示，Chimeric-1829包含来自AAV1、2、8和9的基因组片段，其中AAV2对三倍对称轴的表面loop有贡献，而AAV1和9分别对二倍和五倍对称的相互作用有贡献。与AAV2相似，Chimeric-1829利用硫酸肝素作为主要受体，但它在骨骼肌、肝脏和大脑中有明显的趋向性；它能更有效地转导黑色素瘤细胞；并且具有独特的免疫学特征。

AAV LP2-10：由AAV血清型2、6、8和9的衣壳组成，其中VP3亚基来自AAV8与AAV6的261-272残基互换。AAV LP2-10在保留了与AAV8转导人类肝细胞相似效率的同时， AAV LP2-10又在IVIG和人血清样本中，表现出更高的NAbs逃逸能力。

6. 衣壳的随机突变

另一种改造AAV衣壳的方法是通过随机突变来产生新的衣壳DNA。这一方法可以通过修改PCR条件来完成，主要手段包括易错PCR和StEPPCR。目前常见的是以AAV2为基础，构建10⁶-10⁷个多样性的文库，以此来寻找可以逃避中和抗体，并保持AAV2的其他功能特性不受影响的新衣壳。还有的工作将AAV2进行全密码子的替换、插入和缺失突变，并在体外和体内进行评估。这个方法可以结合机器学习指导下的新AAV衣壳设计，其性能可能也优于随机诱变产生的AAV。

7. 肽库的插入

在AAV衣壳的改造中，常见的方法还包括在VP环（目前首选AAV2的VP1，587、588和其他血清型的对应位点）中插入随机肽（通常是7个氨基酸长）以产生一个随机衣壳文库。然后用这个库来进行所需表型的进化选择，所选择的表型通常与特定的靶向性或逃避NAbs有关。在初次应用该策略时，科研人员在人类冠状动脉内皮细胞上筛选到了一个随机多肽插入的AAV2衣壳。多肽的插入增强了新衣壳对冠状动脉内皮细胞的转导，在对照的非内皮细胞中，该衣壳的泄露水平没有增强。但同时作者也指出，肽库插入AAV文库的筛选和其它需要定向进化的衣壳文库一样，受到了很多的限制。

作者在本章着重提到了CREATE：一个基于Cre-recombination的AAV定向进化方法，这也是AAV肽库插入衣壳文库中最有趣的案例之一，它既显示了其巨大的潜力，也突出了其可能的局限性。该方法首先筛选出了AAV-PHP.B变体，该变体在静脉注射后能有效而广泛地转导成年小鼠中枢神经系统（CNS）。后来又获得了两个改良版本，即AAV-PHP.eB和AAV-PHP.S。然而这几个病毒良好的特性并没有特性并没有扩展到非人灵长类动物或其他常用的小鼠品系如BALB/c上。直接进化方法的优点之一，是不需要知道究竟什么是决定目标衣壳成功表型的因素（例如受体和相应的结合位点的改变？避免的抗体识别的表位？）。但问题是这样的受体或表位在不同的物种中不一定是保守的，甚至在某一特定物种的不同品系中也不一定是保守的。因此进化出的衣壳特性，也很难在不同体系中获得完全一致的结果。

因此，AAV衣壳文库应在其预定的最终目标中进行进化。在之前的结果中我们已经看到，在体外进化选择的文库与体内的结果之间就已经很难转化，因此如何从AAV文库中选择好的载体去用于人类的基因传递还是一个很大的挑战。

除此之外，作者还点名了化学共轭和非自然的AAV载体、多倍体AAV衣壳和在AAV衣壳上共价连接Partner等手段，感兴趣的同学也可以关注一下。

二．克服抗AAV免疫反应的策略

AAV之所以成为基因治疗的首选载体，原因之一就是其免疫原性相对较低。但即便如此，找到有效的策略来规避预先存在的抗AAV免疫反应、防止机体对载体产生新的体液和细胞反应，对推动基因治疗领域发展来说也是十分必要的。

• 根据预先存在的免疫率，选择在普通人群中发病率最低的载体血清型。预先存在的中和抗体（NAbs）能够降低、阻止AAV的感染，这一点已经有充分的证据了。其中AAV2在普通人群中具有最高的NAbs血清流行率，这使得该血清型不太适合于系统性给药。在人类中NAbs血清流行率最低的血清型是AAV8和AAV5。

• 消除循环NAbs或产生抗体的B细胞。例如用血浆置换法来消除患者血清中的AAV特性NAbs。

• 链球菌内肽酶IdeS（Imlifidase）在体外和体内都能降解抗AAV8的NAbs，因此可以使用IdeS消除抗AAVs的NAbs。

• 避免产生靶向AAV转导细胞的特异性CD8+T细胞。衣壳蛋白的多肽由抗原呈递细胞（APCs），呈现在主要组织相容性复合体（MHC）I类和II类中，分别构成AAV特异性CD8+和CD4+T细胞激活的第一个信号。APCs感受到PAMPs提供的共刺激和细胞因子信号也是诱导新生AAV特异性T细胞的必要条件。在细胞外，衣壳蛋白蛋白被APC表面的Toll样受体2（TLR2）感知，而在细胞内，病毒基因组中存在的未甲基化的CpG基团则被TLR9识别。因此，在基因组序列中除去CpG或者在转基因序列中加入TLR9抑制性寡核苷酸，也是避免T细胞激活的潜在解决方案。

• 在临床中，需要使用皮质类固醇来降低病人的免疫毒性反应。

三．载体基因组设计

1. 启动子

由于AAV的装载能力十分有限，因此科研人员一直在努力寻求短且强的启动子。目前来说，有两种主要的策略：

• 第一种策略是去测试天然基因启动子的不同缩短序列，以此来确定最小/核心启动子序列，例如，光感受器特异性荷尔蒙激酶核心启动子；

• 第二种策略是将已知的增强子和启动子合理地组装在一起，从而产生短而强的组成型/组织特异性的混合启动子。这种策略还可以通过计算进一步完善，例如从microarrays和全基因组功能分析中确定组织特异性启动子/强启动子相关的转录因子的结合点以及其他顺式作用序列。通过将短的组织特异性增强子装配到不同的启动子上游，可以大大增强目的基因的组织特异性表达。

2. AAV的ITR

科研人员在AAV2的ITR序列中发现了几个可以与转录因子结合的motif，因此ITR也会影响启动子的其实转录能力。因此，在未来也可能需要根据启动子和目标组织去改变ITR的序列，这一点有些玄幻了~

3. RNA加工元件

除了启动子的选择以外，基因表达盒的设计还需要考虑一些其它方面：

• 例如加入一些不同长度的内含子序列，并与不同的启动子结合使用。目前常见的内含子包括混合β-肌动蛋白/β- 球蛋白，混合腺病毒/免疫球蛋白，混合β-球蛋白/免疫球蛋白重链或MVM 内含子等等。

• 此外，在转基因的3'端添加RNA加工序列也可以提高转基因的表达水平，如WPRE，它可以促进mRNA向细胞质的输出，或短UC-rich元素，它可以通过与PCPB1蛋白的结合来改善mRNA的稳定性。

• Poly-A的选择也会影响转基因的表达水平。例如，与bGH或长SV40的poly-A序列相比，缩短的SV40Poly-A信号会降低AAV载体的转基因表达水平。

• 除了转基因表达所需的poly-A信号外，还可以考虑在转基因序列的反向方向，安置第二个Poly-A信号，从而终止由ITR引起的转录，避免形成dsRNA引起免疫反应。

• 在3'非翻译区添加microRNA目标序列可用于抑制转基因在某些不希望的细胞类型中的表达。这在全身给药的情况下特别有用，例如，通过添加miR122a靶序列，可以限制目标基因在肝脏中的表达。

4. 编码区的序列优化

AAV载体中转基因编码序列的优化可以涵盖几个方面，其中主要包括增强基因表达和降低转基因的免疫原性，例如优化密码子的使用，提高基于密码子适应指数，减少重复序列和二级结构，提高翻译效率等等。

5. 载体基因组的大小

在设计AAV载体时还必须考虑另一个参数就是基因组的大小。野生型AAV的基因组约为4.7-4.8kb，而AAV衣壳的包装极限已被证明约为5.0-5.1kb。

• 超过这个包装能力的过大的载体会导致包装进碎片化的基因组。这些碎片化的载体仍能通过在目标细胞中重叠的碎片之间进行同源重组来介导转基因的表达，但载体制剂含有更多的异质颗粒，空衣壳的比例更高，这对临床产品来说是不理想的。因此一些研究正在用双载体系统，来克服基因组装载能力不足的缺点。

• 在转基因很小的情况下，调整载体大小的策略我们却知之甚少。目前发现含有3.4和4.1kb小基因组的AAV颗粒比含有野生型大小基因组的颗粒更稳定

• 对于单链AAV来说，载体的基因组大小最好调整到4.7±0.1kb，以符合野生型病毒基因组的大小。

• 在转基因较小的情况下，可以考虑几种策略来实现这一点：第一，选择转基因调控元件，从而使其加在一起时达到目标大小。然而，考虑到可用的调控元件数量有限，以及编码序列大小不确定性，这可能是一个巨大的挑战。第二，使用填充物（或间隔物）DNA序列，理论上它可以位于转基因表达盒的上游或下游，和/或一些调控元件之间。一些依赖辅助剂的腺病毒载体的基因组必须要与野生型病毒基因组大小相匹配，才能以实现包装，因此对这类载体来说，使用一些DNA序列做填充是必须且目前已经是可行的。

四. AAV的生产

• 目前常见的AAV生产包括以下几种方法：在哺乳动物细胞中进行瞬时质粒DNA转染；用腺病毒感染稳定的哺乳动物细胞系；用重组杆状病毒感染昆虫细胞；以及用重组单纯疱疹病毒（rHSVs）感染哺乳动物细胞。

• 瞬时转染的优点是可以快速生产和测试新的rAAV构建体，以及没有残留的辅助病毒污染。但这种工艺有一个问题就是质粒骨架序列也可能被包装进AAV的病毒颗粒中。这可能导致先天免疫系统的激活，并导致抗生素抗性基因的传播。

• 就产量而言，用重组杆状病毒（BEV）感染昆虫细胞与用哺乳动物细胞相当，都在10³-10⁶ 个AAV/细胞。但Sf9和哺乳动物细胞制造平台产出的AAV表现出不同的化学和功能，例如不同的衣壳蛋白体翻译后修饰，BEV生产的AAV可能有更差的包装百分比。

在这篇review中，大佬带读者们回顾了科研人员为克服AAV作为基因传递系统的限制，在AAV衣壳改造、基因组设计以及病毒生产中的努力。总体来说，可行的手段还是依旧，目前有理论优势的方法已经有些不错的产出，但其是否真正有效还需要临床上的检验。

参考资料：

Pupo,A., Fernández, A., Low, S. H., François, A., Suárez-Amarán, L., &Samulski, R. J. (2022). AAV Vectors: The Rubik’s Cube of Human GeneTherapy. Molecular Therapy.